H Ελλάδα συμπεριλαμβάνεται στις χώρες με τα υψηλότερα επίπεδα μικροβιακής αντοχής και ταυτόχρονα κατέχει μία από τις πρώτες θέσεις στην κατανάλωση αντιβιοτικών.
Είναι γνωστό ότι η Ελλάδα συμπεριλαμβάνεται στις χώρες με τα υψηλότερα επίπεδα μικροβιακής αντοχής και ταυτόχρονα κατέχει μία από τις πρώτες θέσεις στην κατανάλωση αντιβιοτικών. Παράλληλα, η δημιουργία νέων αναδυόμενων αντοχών αποτελεί μείζον πρόβλημα καθώς αυξάνονται οι σοβαρές λοιμώξεις από ανθεκτικά στελέχη, πληθαίνουν οι πάσχοντες από σοβαρά νοσήματα. Σημαντικό, λοιπόν, είναι να κατανοήσουμε την έννοια της ευαισθησίας των μικροβίων στα αντιβιοτικά, τους μηχανισμούς αντοχής τους καθώς και τις μεθόδους εφαρμογής ενός αντιβιογράμματος.
Το αντιβιόγραμμα είναι το αποτέλεσμα εργαστηριακών δοκιμών προσδιορισμού της ευαισθησίας ενός βακτηριακού στελέχους σε διαφορετικές κατηγορίες αντιβιοτικών. Πρωταρχικός σκοπός ενός αντιβιογράμματος είναι να μετρηθεί η ευαισθησία ενός μικροβίου στα κοινά αντιβιοτικά ενώ ως δευτερεύων στόχος είναι η ανίχνευση μιας πιθανής αναδυόμενης αντοχής, που μπορεί να οφείλεται σε νέους μηχανισμούς ανθεκτικότητας. Η in vitro ευαισθησία, όμως, δεν εγγυάται απαραίτητα και κλινική ανταπόκριση. Ως εκ τούτου, η απόφαση για τη θεραπεία δεν θα πρέπει να βασίζεται αποκλειστικά και μόνο στο εργαστηριακό αποτέλεσμα της δοκιμής στα αντιβιοτικά.
Δράση των αντιβιοτικών
Η δράση των αντιβιοτικών, όπως φαίνεται στο σχήμα 1, διαφέρει ανά κατηγορία και σύντομα αναφέρουμε μερικά παραδείγματα:
Σχήμα 1. Στόχοι δράσης των αντιβιοτικών
- Τα β-λακταμικά, η Vancomycin και η Bacitracin δρουν στο τοίχωμα των βακτηρίων.
- Οι πολυμυξίνες (colistine) δρουν στην κυτταρική μεμβράνη.
- Οι κινολόνες, η ριφαμπικίνη και οι σουλφοναμίδες αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό του γενετικού υλικού του βακτηρίου.
- Οι μακρολίδες, οι αμινογλυκοσίδες, οι τετρακυκλίνες κ.α. αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση του βακτηρίου.
Μηχανισμοί αντοχής
Οι μηχανισμοί αντοχής των βακτηρίων στα αντιβιοτικά διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: τη φυσική ή ενδογενή αντοχή και την επίκτητη αντοχή. Παρακάτω αναφέρουμε τα κύρια χαρακτηριστικά τους και τους τρόπους που αυτές οι αντοχές επιτυγχάνονται.
Φυσική ή Ενδογενής αντοχή
Είναι χρωμοσωμική, ανεξάρτητη της χρήσης αντιβιοτικών και υπάρχει σε όλα τα στελέχη των μικροβίων. Για παράδειγμα τα εντεροβακτηριακά είναι ανθεκτικά στην πενικιλλίνη ενώ οι εντερόκοκκοι είναι ανθεκτικοί στις κεφαλοσπορίνες.
Επίκτητη αντοχή
Η επίκτητη αντοχή μπορεί να επιτευχθεί είτε με σημειακές μεταλλάξεις στο χρωμόσωμα είτε με απόκτηση εξωγενούς γενετικού υλικού από άλλα βακτήρια. Σχετίζεται με την χρήση αντιβιοτικών και υπάρχει σε ορισμένα στελέχη μικροβίων. Αναλυτικότερα επιτυγχάνεται:
Με σημειακές μεταλλάξεις στο χρωμόσωμα (mutations) :
Οι σημειακές μεταλλάξεις συμβαίνουν σπάνια, είναι τυχαίες και αφορούν το χρωμοσωμικό DNA. Επιλέγονται υπό την πίεση των αντιβιοτικών και προκαλούν ανθεκτικούς πληθυσμούς. Για παράδειγμα είναι η μεταλλαγμένη θέση πρόσδεσης της πενικιλλίνης της πρωτεΐνης PBP-2a του σταφυλοκόκκου ανθεκτικού στην methycilin (Methycillin Resistant Staphylococcus Aureus-MRSA).
Με την απόκτηση εξωγενούς γενετικού υλικού από άλλα βακτήρια (Μεταφορά γονιδίων - Φορείς γονιδίων).
Υπάρχουν τρεις τρόποι απόκτησης εξωγενούς υλικού που αναλύονται επιγραμματικά παρακάτω:
- Η Μεταμόρφωση ή Μετασχηματισμός: Είναι η διαδικασία πρόσληψης από ορισμένα βακτήρια μορίων χρωμοσωμικού DNA, το οποίο έχει προκύψει από τη λύση-αποσύνθεση άλλων βακτηρίων και βρίσκεται ελεύθερο στο περιβάλλον. Το ξένο DNA εισέρχεται στο κύτταρο-δέκτη όπου ενσωματώνεται στο χρωμόσωμα σχηματίζοντας με ανασυνδυασμό τα «μωσαϊκά» γονίδια. Η ενσωμάτωση του DNA είναι εφικτή εφ’ όσον προέρχεται από «συγγενή» βακτήρια. Συνηθίζεται σε gram (+) κόκκους.
- Η Σύζευξη: Ο κυριότερος μηχανισμός μεταβίβασης γονιδίων αντοχής στα gram (-) βακτήρια. Η μεταβίβαση του γενετικού υλικού γίνεται με τα πλασμίδια τα οποία φέρουν ένα ή περισσότερα γονίδια αντοχής (πλασμίδια πολλαπλής αντοχής). Τα πλασμίδια είναι εξωχρωμοσωμικά κυκλικά μόρια διπλής έλικας DNA, τα οποία αντιγράφονται αυτόνομα σε σχέση με το βακτηριακό χρωμόσωμα. Καμιά φορά μάλιστα ενσωματώνονται στο χρωμόσωμα. Στη σύζευξη απαιτείται άμεση επαφή μεταξύ δύο βακτηρίων (δότη και δέκτη), η οποία εξασφαλίζεται με ειδικά ινίδια (συζευτικά – αυτομεταφερόμενα πλασμίδια). Στα πλασμίδια αντοχής μπορούν να ενσωματωθούν: 1) μεμονωμένα γονίδια αντοχής 2) τρανσποζόνια 3) ιντεγκρόνια
- Η Μεταγωγή: Γίνεται με τη μεσολάβηση των ιών π.χ. όταν ένα βακτήριο προσβάλλεται από έναν βακτηριοφάγο. Κατά την πορεία πολλαπλασιασμού του βακτηριοφάγου στο βακτηριακό κύτταρο μικρά τμήματα του βακτηριακού DNA μπορούν τυχαία να ενσωματωθούν στον ιό. Όταν ο ιός προσβάλλει ένα άλλο βακτήριο το DNA από το πρώτο ελευθερώνεται στο δεύτερο βακτήριο. Συχνά το δεύτερο βακτήριο θανατώνεται από τον ιό, αν όμως επιζήσει, το πιθανότερο είναι τα ένζυμα να αποπολυμερίσουν το ξένο DNA, παρά να το ενσωματώσει. Ο δέκτης αποκτά ιδιότητες που δεν είχε προηγουμένως. Ο μηχανισμός αυτός δεν φαίνεται να συμβάλλει σημαντικά στην επίκτητη αντοχή των παθογόνων βακτηρίων όμως συμβάλλει στην ανταλλαγή γενετικού υλικού μεταξύ των βακτηρίων του εδάφους.
Οι παραπάνω αλλαγές στο γενετικό υλικό των βακτηρίων οδηγούν στην παραγωγή πρωτεϊνών με διαφοροποιημένη δράση (αντοχή). Έτσι παρατηρούμε:
- Παραγωγή αδρανοποιητικών ενζύμων:τέτοια είναι π.χ. οι β-λακταμάσες που αδρανοποιούν τα β-λακταμικά αντιβιοτικά και παράγονται και από Gram (+) και Gram (-) βακτήρια (πχ. ESBL), όπως και ένζυμα έναντι των αμινογλυκοσιδών που παράγονται από Gram (+) και Gram (-) βακτήρια και αλλάζουν τη δομή του μορίου των αμινογλυκοσιδών ( π.χ. E.coli, Klebsiella, Pseudomonas).
- Μεταβολές στις πενικιλλινοσυνδετικές πρωτεΐνες (PBP):Βρίσκονται στον περιπλασματικό χώρο των Gram (+) κόκκων και δεσμεύουν τις πενικιλλίνες και τα άλλα β-λακταμικά και δεν τους επιτρέπουν να προχωρήσουν στο εσωτερικό του μικροβίου (π.χ. η αντοχή των σταφυλοκόκκων στη μεθικιλλίνη (MRSA) οφείλεται σε μεταβολή της PBPΑ2).
- Μεταβολή στη διαπερατότητα των πορινών:Αλλαγές στη δομή των πορινών εμποδίζουν την είσοδο αντιβιοτικών στο εσωτερικό του βακτηρίου.
- Τροποποίηση του τρόπου δράσης:Εμφανίζεται μεταξύ στελεχών ορισμένου είδους που χάνουν την ευαισθησία τους σε συγκεκριμένο αντιβιοτικό (π.χ. Τετρακυκλίνες, Τριμεθοπρίμη και Σουλφαμεθοξαζόλη).
Εμφάνιση του φαινομένου της ανοχής: Είναι η in vivo ανθεκτικότητα ενός μικροβίου ενώ in vitro είναι ευαίσθητο. Παρατηρείται σε Gram (+) κόκκους έναντι β-λακταμικών αντιβιοτικών. Η κλινική σημασία του φαινομένου αυτού είναι ότι ο ασθενής δεν ανταποκρίνεται στην αντιμικροβιακή θεραπεία.
Μέθοδοι ελέγχου ευαισθησίας στο εργαστήριο
Παρακάτω παραθέτουμε τις μεθόδους του αντιβιογράμματος που χρησιμοποιούνται σήμερα.
Μέθοδος Διάχυσης των Δίσκων (Kirby – Bauer)
O μικροοργανισμός ενοφθαλμίζεται στο θρεπτικό υλικό πάνω στο οποίο τοποθετούνται οι δίσκοι των αντιβιοτικών. Μετά από επώαση στους 37οC για 24h έως 48h μετρούμε τις ζώνες αναστολής.
Επαγωγική αντοχή (inducible resistance):
Εμφανίζεται κατά τη διάρκεια θεραπείας με ένα αντιβιοτικό σε στέλεχος μικροβίου που ήταν ευαίσθητο στο αντιβιοτικό αυτό. Παρατηρείται:
- Στα Gram (-) Βακτηρίδια έναντι των β-λακταμικών (παραγωγή επαγωγικών β-λακταμασών)
- Στις αντιψευδομοναδικές πενικιλλίνες και κεφαλοσπορίνες 2ης και 3ης γενιάς.
Παρατηρείται για παράδειγμα σε βακτηρίδια όπως Enterobacter, Serratia, Pseudomonas
Μέθοδος Κλιμακωτής Διάχυσης (E-TEST)
Μέθοδος στην οποία δε χρησιμοποιείται δίσκος αντιβιοτικού αλλά ένα ειδικό “strip” εμποτισμένο με το αντιβιοτικό. Παρατηρείται μια ελλειπτική ζώνη αναστολής και το σημείο όπου η έλλειψη συναντάει το Strip μας δίνει την ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του αντιβιοτικού.
Μέθοδος Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης (MIC)
Η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (minimum inhibitory concentration - MIC) ορίζεται ως η μικρότερη πυκνότητα του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροβίου. Με τη μέθοδο αυτή, επιλέγεται κάθε φορά το καταλληλότερο panel αντιβιοτικών προκειμένου να αποφευχθεί η αποτυχία μιας θεραπείας.
Η MIC χρησιμοποιήθηκε στην αρχή σαν manual τεχνική, σήμερα όμως είναι πλήρως αυτοματοποιημένη. Πρόκειται για μέθοδο μικροαραιώσεων με τη χρήση 64 μικρουποδοχών: μια υποδοχή ελέγχου ανάπτυξης μικροβίου (control) και υποδοχές προμετρημένων ποσοτήτων αντιβιοτικών .
Αφού γίνει το εναιώρημα συγκεκριμένης θολερότητας ακολουθεί η συμπλήρωση, το σφράγισμα και η τοποθέτηση της κάρτας στην αυτόματη μονάδα επώασης/ανάγνωσης. Γίνεται παρακολούθηση της ανάπτυξης κάθε 15 min (φθορισμός, θολερότητα, χρώμα) και προσδιορίζεται η MIC μέσα σε 5 έως 18ώρες.
Τα αποτελέσματα όλα προσδιορίζονται και για τις τρεις μεθόδους σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του CLSI.
Μετά από αυτή τη σύντομη περιγραφή της έννοιας, της χρησιμότητας και των μεθόδων του αντιβιογράμματος καθώς και των αντοχών των μικροβίων στα αντιβιοτικά κρίνεται απαραίτητο να σημειωθεί ότι η ευαισθητοποίηση της κοινότητας για ορθολογική χρήση τους είναι σημαντική για τον περιορισμό των μικροβιακών αντοχών. Απαιτείται επομένως η επιτήρηση των λοιμώξεων από πολυανθεκτικούς μικροοργανισμούς στα νοσοκομεία και η ευαισθητοποίηση κοινού και επαγγελματιών Υγείας ώστε επιτευχθεί το βέλτιστο αποτέλεσμα.
Νάντια Κοντογιάννη
Βιολόγος-Επιστημονική Συνεργάτης Medisyn
Βιβλιογραφία
- Αντιβιοτικά. Νίκος Ι. Λεγάκης, Τάσος Η. Περόγαμβρος
- Κλινική Μικροβιολογία και εργαστηριακή διάγνωση λοιμώξεων. Αντιγόνη Αρσένη
- Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία. Πανεπιστήμιο Αθηνών. Ρ. Λεκανίδου, Σ. Τσιτήλου, Γ. Ροδάκης
- Εισαγωγή στη Βοτανική. Πανεπιστήμιο Αθηνών. Γαλάτης Β. Κατσαρός Χ. Αποστολάκος Π.
- Προσδιορισμός MIC και MBC. Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική. Περίοδος Β, Τόμος 11, Τεύχος 2, σελ. 77-85. 2007. Γ. Βρυώνη
- Μηχανισμοί αντοχής των Gram (+) και Gram (-) βακτηρίων στα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Ευαγγελία Λεμπέση. Διευθύντρια ΕΣΥ Μικροβιολογικό Εργαστήριο Νοσοκομείο Παίδων Αθηνών «Π. & Α. Κυριακού».
- «Όμηροι των υπερβακτηρίων». Tσώλη Θεοδώρα. tovima.gr/science 27 Νοε. 2011