Οι εξελίξεις στη Μοριακή Γενετική ανάλυση έχουν φέρει πραγματική επανάσταση στην πρακτική της Ιατρικής, βελτιώνοντας την προ-γεννητική και αναπαραγωγική φροντίδα, επιτρέποντας την έγκαιρη ανίχνευση μεταδοτικών και μη παθήσεων και εξελίσσοντας τη θεραπεία των κληρονομικών νόσων
Νέες γνώσεις, νέοι στόχοι στη διαγνωστική ιατρική
Προλογίζει ο Τάκης Αποστολόπουλος
Βιολόγος-Κλινικός Χημικός
Επιστημονικός Συνεργάτης Iatrica
Καθώς η ζήτηση ασθενούς και ιατρού για προσδιορισμό της γονιδιακής αλληλουχίας συνεχίζει να αυξάνεται, είναι επιτακτική η ανάγκη της επιτάχυνσης της κλινικής χρήσης των πρωτοποριακών τεχνικών που βασίζονται σε αλληλούχιση νέας γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) για διαγνωστικές εξετάσεις ρουτίνας. Το IATRICA πρωτοπορώντας κατόρθωσε να παρακάμψει τα συνήθη υφιστάμενα εμπόδια για τη συνήθη χρήση των πρωτοποριακών τεχνικών σε νοσοκομεία και κλινικές σε όλη την Ευρώπη και να τις παρέχει στο δίκτυο του ,σε μια ασυναγώνιστη σχέση οφέλους και κόστους. Επειδή όλα αυτά απαιτούν και εμβάθυνση γνώσης στους συνήθεις χρησιμοποιούμενους συνδυασμούς Μοριακής Γενετικής ανάλυσης σας παραθέτουμε μια πλοήγηση στη πραγματική επανάσταση που έχει επιφέρει στην πρακτική της Ιατρικής μέσω ενός ειδικού όπως ο Υπεύθυνος Μοριακής Μικροβιολογίας & Γενετικής της ΒΙΟΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ – ΓΕΝΟΤΥΠΟΣ Παντελής Κωνσταντουλάκης, PhD.
Η μοριακή γενετική διαγνωστική του σήμερα και του αύριο
Οι εξελίξεις στη Μοριακή Γενετική ανάλυση έχουν φέρει πραγματική επανάσταση στην πρακτική της Ιατρικής, βελτιώνοντας την προ-γεννητική και αναπαραγωγική φροντίδα, επιτρέποντας την έγκαιρη ανίχνευση μεταδοτικών και μη παθήσεων και εξελίσσοντας τη θεραπεία των κληρονομικών νόσων. Πρωτοποριακές τεχνικές που βασίζονται σε αλληλούχιση νέας γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) και μικροσυστοιχίες αναπτύσσονται συνεχώς και μας βοηθούν να ξεκλειδώσουμε τα μυστήρια και τις δυνάμεις του γονιδιώματος. Όταν θα μπορέσουμε ως εργαστηριακοί επιστήμονες να εκμεταλλευτούμε πλήρως τα εργαλεία αυτά, θα είμαστε μάρτυρες αλλαγών στη φροντίδα υγείας που δεν θα μπορούσαμε ποτέ να φανταστούμε. Τελικά, οι νέες αυτές τεχνολογίες μας δίνουν τη δυνατότητα να βελτιώσουμε την υγεία και την ποιότητα ζωής του ανθρώπου. Όμως, όπως όλα τα θαυμάσια νέα ¨παιχνίδια¨ (gadgets), οι τεχνολογίες αυτές έχουν οδηγίες χρήσης που είναι πολύ διαφορετικές από εκείνες που έχουμε ως τώρα συνηθίσει στην εργαστηριακή Iατρική Διάγνωση. Είναι αδύνατον πλέον, ένας Βιολόγος ή άλλος επιστήμονας με γνώσεις Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής που απέκτησε στις σπουδές του την προηγούμενη δεκαετία ή εικοσαετία να μπορέσει να εφαρμόσει έτσι απλά και να συμπεριλάβει στη ρουτίνα του τις τεχνικές αυτές του σήμερα, καθώς οι απαιτήσεις τους είναι πολύ διαφορετικές από τα γνωστά. Δεν μιλάμε πλέον για την εφαρμογή ενός πρωτοκόλλου μιας αντίδρασης PCR ή την ανάγνωση μιας αλληλουχίας DNA από γενετικό αναλυτή, αλλά για μια πολύ περίπλοκη διαδικασία προετοιμασίας του δείγματος, έτσι ώστε να μπορέσει η τεχνολογία της παράλληλης αλληλούχισης, για παράδειγμα, να αξιοποιήσει κάθε τμήμα του αρχικού βιολογικού υλικού.
Πιο συγκεκριμένα, οι τεχνικές ανάγνωσης της αλληλουχίας όλων των περιοχών ενός γονιδίου ή γονιδίων, με την τεχνική NGS, προϋποθέτει τον επιμελή και επιτυχή πολλαπλασιασμό κατάλληλα επιλεγμένων τμημάτων DNA και στη συνέχεια τη σήμανση αυτών και παράλληλη αλληλούχιση χιλιάδες φορές κάθε τμήματος μέσα από μια ¨βιβλιοθήκη¨, στην οποία θα πρέπει όλα τα τμήματα να αντιπροσωπεύονται επαρκώς. Αυτό σημαίνει ότι τα αναλυτικά όργανα, όπως συσκευές PCR, φασματοφωτόμετρα, αναλυτές NGS και οι τεχνικές διαχωρισμού και καθαρισμού του γενετικού υλικού, θα πρέπει να λειτουργούν με απίστευτη ακρίβεια και συντονισμό για να επιτευχθεί το βέλτιστο αποτέλεσμα που θα επιτρέψει τη σωστή διάγνωση. Άρα πλέον οι ¨in house¨ τεχνικές και πρωτόκολλα και τα αμφισβητούμενης ακρίβειας εργαστηριακά όργανα δεν έχουν καμιά θέση στο εργαστήριο της Μοριακής Γενετικής του σήμερα, το οποίο φαντάζει ως χώρος από ταινίες επιστημονικής φαντασίας, με ρομποτικά συστήματα απομόνωσης και διαχείρισης των δειγμάτων. Παραδειγματικά, θα αναφέρω ότι για την ανάλυση των μεταλλάξεων των γονιδίων BRCA1/2 (κληρονομούμενος καρκίνος μαστού) σε ένα δείγμα, θα χρειαστεί κανείς περίπου 40-50 δοκιμαστικά σωληνάρια, με αντίστοιχα ρύγχη μικροπιπετών και περίπου δύο ημέρες αποκλειστικών διαδικασιών προτού περάσει μέσα στον αναλυτή NGS. Άλλωστε πως μπορεί κανείς να δώσει απάντηση με Research Use Only (RUO) υλικά και πρωτόκολλα, όταν πρόκειται πλέον για διαγνωστική εξέταση (CE/IVD) που θα αποφασίσει αν ενδείκνυται ακρωτηριασμός ατόμου (μαστεκτομή) ή διακοπή της ζωής αυτού (προγεννητικός έλεγχος);
Τέλος, ερχόμαστε στο μεγάλο ζήτημα της ανάλυσης των αποτελεσμάτων. Ενώ μέχρι σήμερα, οι αναλύσεις των Μοριακών εξετάσεων μπορούσαν να γίνουν σχετικά εύκολα με σύγκριση με καμπύλη αναφοράς (Real Time PCR) ή με διαπίστωση ή έλλειψη μιας ζώνης σε μια ηλεκτροφόρηση ή χρώμα σε κάποιο υβριδισμό (End Point PCR), ή ακόμα με την ύπαρξη κορυφών σε ένα διάγραμμα (συμβατική αλληλούχιση) τα αποτελέσματα των αναλύσεων των NGS εξετάσεων είναι τεράστια αρχεία (πολλά gigabytes) από νουκλεοτιδικές αλληλουχίες (ΑATTCGACTAGCC…). Τα αρχεία αυτά θα πρέπει στη συνέχεια και με τρόπο και μέθοδο σίγουρα πιστοποιημένη για διάγνωση να συγκριθούν προσεκτικά με τα αρχεία του Προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος και να εξαχθούν συμπεράσματα με βάση την υπάρχουσα γνώση και βιβλιογραφία για καθεμιά αλλαγή από το ¨φυσιολογικό¨. Η ανάλυση αυτή απαιτεί ιδιαίτερα εξειδικευμένες γνώσεις Βιοπληροφορικής, αλλά και Γενετικής και την εξασφάλιση ότι καλύπτει όλες (ή τις περισσότερες δυνατόν) τις πιθανές ατέλειες του εργαστηριακού μέρους.
Ολοκληρώνοντας, τη σύντομη αυτή αναφορά στο ατελείωτο ταξίδι πέρα από τα όρια του σήμερα που έχουμε ξεκινήσει μαζί, θέλω να δηλώσω ότι προσωπικά, μετά από πορεία 35 ετών στη Μοριακή Βιολογία και τη Γενετική κι έχοντας δημιουργήσει και εφαρμόσει εκατοντάδες ¨in house¨ πρωτόκολλα από την αρχή της εφαρμογής της επιστήμης μας στη Διάγνωση, είμαι πλέον απόλυτα ήρεμος και σίγουρος γιατί διαθέτω ως συμμάχους στην εφαρμογή των νεότερων εξετάσεων επόμενης γενιάς εταιρείες όπως η Illumina (www.illumina.com), η Multiplicom (www.multiplicom.com) και η Sophia Genetics (www.sophiagenetics.com).
Παντελής Κωνσταντουλάκης, PhD
Υπεύθυνος Μοριακής Μικροβιολογίας & Γενετικής της ΒΙΟΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ – ΓΕΝΟΤΥΠΟΣ